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問：請問為什么直徑提高十倍，強度為什么也是提高十倍，不應該是是提高10的三次方倍嗎？謝謝
答：謝謝！我們描述定量問題的結果是二維投影圖，在二維投影圖中，事實上我們是將沿著貝塞爾光傳輸路徑上產(chǎn)生的SRS信號進行了累積，因此是沿著直徑方向的累積，所以強度相差應該是10倍。
問：儀器使用的軟件后期升級需要自己購買嗎？
謝謝您的關注。我們目前的儀器還沒有商業(yè)化，只是實驗室科研開發(fā)的儀器和配套軟件。如果有需要，我們可以提供使用或者部分算法源代碼。
問：陳老師，所以用貝塞爾投影拉曼成像，想得到表層的樣品信息，就是必須旋轉樣品，然后后期軟件來算的是嗎？
答：謝謝！是這樣的。如果不采用旋轉斷層策略的話，我們得到的是一定深度內的信息；只有通過樣本旋轉，然后利用斷層重建算法將樣品的三維信息恢復出來，我們就可以得到樣品的三維體積內所有位置的拉曼散射信息。
問：陳老師，好！請問內窺拉曼和內窺熒光在活檢臨床上的應用，例如在腫瘤檢測方面的應用概況是怎樣的？
答：謝謝！據(jù)我所了解的(也有可能不完全準確)，無論是內窺拉曼還是內窺熒光還都沒有真正應用于臨床活檢上，更多的還是探索性的研究。內窺拉曼的優(yōu)勢在于不需要熒光標記，從而不需要引入外源物，能更快的應用于臨床；但它的缺點是信號比較弱，在生物體特別是人體臨床應用的復雜環(huán)境下，能否采集到有效的拉曼信號是個問題。
問：陳老師，好！請教一下，共焦熒光成像和共焦拉曼成像，在實際應用方面各有什么樣的優(yōu)缺點？
答：謝謝！共聚焦熒光成像在生物醫(yī)學領域還是公認的重要工具，這點目前共聚焦拉曼還取代不了。共聚焦熒光成像由于我們是用熒光染料或蛋白標記了我們想看的成分或分子，所以熒光顯示的就是我們想看的東西；而共聚焦拉曼由于是無標記成像，因此需要同時結合拉曼光譜來確認我們看到的是什么，這也會造成數(shù)據(jù)采集時間會比較長。
答：謝謝！這可能需要從SRS和拉曼光譜檢測兩個方面來說。從SRS技術來看，目前已經(jīng)有基于高斯光束的商業(yè)化的SRS設備，但設備體積比較龐大、價格比較昂貴，而基于拜爾光束的話，只需要增加環(huán)形光產(chǎn)生模塊即可；這個設備商業(yè)化的困難包括兩部分：一個是如何將設備體積縮小，一個是如何將成本降低；而光纖激光器可能是一個比較好的選擇。在自發(fā)拉曼光譜檢測中，貝塞爾光束拉曼光譜儀商業(yè)化遇到的問題可能是設備小型化、以及如何在小型化情況下產(chǎn)生高質量的貝塞爾光。
問：陳老師，您好！目前基于貝塞爾光束的拉曼成像橫向分辨率和徑向分辨率能達到什么數(shù)量級？成像速度能能達到多少？對樣品是否有要求，比如透明樣品或非透明樣品，對樣品的制備、探測，有什么注意事項？
答：謝謝！目前基于貝塞爾光的受激拉曼投影成像系統(tǒng)橫向分辨率大概在0.8-0.9微米(40X物鏡)。系統(tǒng)的橫向分辨率是與采用的物鏡相關的，并且需要與待測樣本厚度之間達到一個平衡；或者說我們可以通過高倍、大NA的物鏡獲得更高的分辨率， 但是能夠測量樣本的厚度或者體積會變小。受激拉曼投影成像是沒有徑向分辨率的，不過我們可以通過結合樣本旋轉、采用斷層重建的方式進行恢復，理論上應該是與橫向分辨率相同的。目前成像速度是在1秒一張投影圖，獲取三維體積的話需要采集180張投影，所以大概在180秒；結合我們后面開發(fā)的稀疏數(shù)據(jù)重建算法，可以將這個時間縮小到15秒左右。樣品需要是透明或者半透明的樣品，所以一般用于斑馬魚、線蟲、果蠅等模式生物的檢測與成像。實驗中，樣品的固定需要采用特定的方式，我們目前正在開發(fā)適用于這種成像方式的樣本固定裝置。
答：謝謝！是這樣的。如果不采用旋轉斷層策略的話，我們得到的是一定深度內的信息；只有通過樣本旋轉，然后利用斷層重建算法將樣品的三維信息恢復出來，我們就可以得到樣品的三維體積內所有位置的拉曼散射信息。
同問：請問為什么直徑提高十倍，強度為什么也是提高十倍，不應該是是提高10的三次方倍嗎？謝謝
答：謝謝！我們描述定量問題的結果是二維投影圖，在二維投影圖中，事實上我們是將沿著貝塞爾光傳輸路徑上產(chǎn)生的SRS信號進行了累積，因此是沿著直徑方向的累積，所以強度相差應該是10倍。
問：陳老師，您好！請教一下：1）樣品一般最厚可以多厚？樣品厚度對光譜信號的影響，如信號的衰減，二次散射、雜散信號等方面。2）樣品是冷凍切片嗎？
答：謝謝！1）在受激拉曼投影斷層成像中，能檢測的樣品的厚度是取決于物鏡，或者說取決于分辨率的需求。如果對分辨率要求比較高，能觀測的樣品厚度較小。在我們發(fā)表的工作中，有一個表格專門列了不同物鏡能夠觀測的樣品厚度。比如，如果選用60X/1.1NA物鏡，樣品厚度大概在400微米，分辨率大概在0.34微米；如果選用10X/0.3NA物鏡，樣品厚度可以達到8個毫米以上，分辨率大概在1.55微米。
2）樣品不是冰凍切片。關于樣品的詳細信息，可以查閱我們文章中的描述。謝謝！
答：謝謝！光譜特征譜峰的位置理論上是與激發(fā)光無關。我們采用貝塞爾光拉曼光譜儀對樣品進行拉曼光譜檢測時，由于技術是一種新技術、并且設備是我們自己搭建的，所以我們需要對設備檢測拉曼光譜的能力和性能進行驗證；而實驗中，測量到的拉曼光譜的譜峰位置很難做到跟標準譜完全一致，我們目前的結果是有一些誤差，但這個誤差是在光譜儀的分辨率范圍內的。或者說我們的光譜儀分辨率大概在9個波數(shù)，而我們測量到的譜峰與標準譜峰位置差異都是小于9個波數(shù)。
答：謝謝！需要注意的地方就是產(chǎn)生的貝塞爾光的質量，這會受到Axicon前端入射的高斯光質量、經(jīng)兩個Axicon產(chǎn)生的環(huán)形光的質量、以及環(huán)形光入射物鏡時的狀態(tài)影響。
答：謝謝！在受激拉曼投影成像中，我們是用光二極管進行拉曼信號的收集和提取。在第三部分的拉曼光譜檢測中是用的光譜儀。
答：謝謝！我們用功率來衡量強度，通過功率計來測量貝塞爾光的功率。
問：貝塞爾光束和高斯光束對樣品的損傷區(qū)別
答：謝謝！如果在相同的總功率情況下，貝塞爾光對樣品的損傷會比高斯光小很多。貝塞爾光從結構上是由一個中心lobe和多個旁瓣組成，并且能量是在中心lobe和旁瓣上平均分配，所以能夠聚焦到樣品上的能量只有中心lobe的，這個能量/功率是高斯光的1/12左右。在熒光成像領域，有學者對這個問題做個研究，而這也是貝塞爾光相比于高斯光的優(yōu)勢之一。
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